Новый метод определения вирусной нагрузки

Количественная генная диагностика бактериальных и вирусных инфекций – результат сотрудничества фирмы «Дельтатех» с профессором Московского университета Борисом Михайловичем Медниковым – ориентирована на мониторинг пациентов во время лечения
В отечественной медицине о течении болезни, вызванной, например, бактериями, микоплазмами, простейшими грибками или вирусами, как и об эффективности лечебных препаратов, обычно судят по результатам биохимических и иммунологических анализов. Гораздо рациональнее было бы следить за развитием или угасанием численности болезнетворного начала непосредственно, т.е. прямо определяя его количество. В настоящее время такой способ интенсивно внедряется в клиническую практику.
Метод основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР). На предложенный количественный вариант группой авторов получен Патент РФ № 96116019 от 1 августа 1996 года. Методика относительно проста в исполнении, чрезвычайно специфична и чувствительна – позволяет выявить в пробе единственный ген. С помощью этого метода удается получить до миллиона копий нужного гена всего за несколько часов, используя ничтожное количество исследуемого образца. Их затем можно «опознать», разделив реакционную смесь, например, электрофорезом в геле. К настоящему времени разработаны модификации ПЦР, в числе которых та, что позволяет выявлять не ДНК, а РНК, и это чрезвычайно важно для определения РНК-содержащих вирусов.
По первым модификациям этого метода можно было судить лишь о наличии вируса в пробе, хотя и они оказались весьма полезными, чтобы понять, есть ли в донорской крови вирусы СПИДа и гепатитов. Однако при терапии инфекционных болезней важно определить не только присутствие, но и количество болезнетворного агента.
В первую очередь это необходимо, чтобы оценить терапевтическое действие применяемых препаратов. Если проследить за динамикой численности вируса в организме пациента, удастся установить, например, эффективны ли азотимидин в терапии ВИЧ-инфекции или интерферон при лечении гепатитов. В повседневной клинической практике суточный ход вирусной нагрузки позволяет правильно выбрать тактику лечения.
  Следует заметить, что для точной оценки количества болезнетворного агента в пробе нужно правильно подобрать число циклов амплификации. Достигается это опытным путем, поэтому время анализа увеличивается, а эксперимент усложняется. На предприятии «Дельтатех» разработана полуавтоматическая система, в которой разделение биополимеров (ДНК, РНК, белков) электрофорезом сочетается с компьютерным считыванием информации с геля и количественной ее обработкой. Прибор, получивший название «Шатер» (ТУ 9443-001-11519975-00), внедрен в производство, прошел клиническую апробацию и позволяет выявить 3–10 нг ДНК в полосе геля, если использовать традиционный флуоресцентный краситель (бромистый этидий). Но, применив для окрашивания недавно разработанные, более совершенные соединения, можно повысить чувствительность установки на три порядка. «Шатер» – это система для гель-электрофоретического анализа смесей биополимеров (ДНК, РНК, нуклеиновых кислот и белков).
Система обеспечивает проведение электрофореза и цифровое, компьютерное считывание информации с геля, находящегося в форезной камере. Считывание фореграммы может производиться как флуоресцентным методом, так и по оптической плотности предварительно окрашенного препарата. Система ориентирована на использование для флуоресцентного прокрашивания традиционного и недорогого бромистого этидия.
Основные преимущества системы:
  • высокая чувствительность – до 0,1нг ДНК в полосе;
  • оптимальное пространственное разрешение – 430 000 (1 300 000) точек изображения;
  • регистрация 4000 градаций яркости;
  • минимальный контакт оператора с гелем и буфером;
  • использование простого в исполнении электрофореза в горизонтальном геле (как агарозном, так и полиакриламидном);
  • исключение процесса фотографирования;
  • себестоимость анализа с помощью «Шатра» примерно в десять раз меньше, чем при выполнении на импортном оборудовании.

В состав системы входят:
  • ячейка для горизонтального гельэлектрофореза – «ЭФК-140 кварц»;
  • блок детектирования – «Шатер-430к/12» (1,4М/12);
  • пакет программного обеспечения «DT-TV».
Иллюстрацией применения системы и метода является мониторинг вирусной нагрузки при лечении гепатита B в инфекционной клинике №1 (подробное описание этой работы содержится в журнале: Природа. 2001, апрель).
Из одной пробы одновременно исследовалось количество вируса и определялась концентрация традиционных ферментов АлАт (аланинаминотрансфераза), АсАт (аспартатаминотрансфераза) и билирубина в крови пациента. Характерный вид электрофореграммы приведен на рис. 1. Для количественного определения вируса в исходную пробу вводился стандарт – известное количество ДНК, амплифицирующейся с той же скоростью, что и вирусная ДНК. На рис.2 представлен график изменения вирусной нагрузки и количества ферментов в процессе лечения. Здесь видно, что всплески количества ферментов запаздывают относительно изменения вирусной нагрузки на три–пять дней. Таким образом, определение вирусной нагрузки дает более раннюю информацию об изменении состояния пациента и должно стать одним из главных диагностических методов при определении тактики лечения.

Александр ВИНОГРАДОВ